多重连接探针扩增(Multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)是MRC-Holland在2002年开发的一种分子技术。它是一种灵敏的技术，可以快速有效地定量核酸序列。它在世界各地的许多实验室进行，可用于检测基因的拷贝数变化(如缺失或复制)，识别DNA的甲基化状态，检测单核苷酸多态性(SNPs)和点突变，量化mRNA。因此，它被应用于许多研究和诊断领域，如细胞遗传学、癌症研究、人类遗传学等。

工作原理
MLPA基本步骤如下，具体见图解

1.变性

2.杂交

3.连接

4.扩增（通过PCR）

5.片段分离和数据分析

详细解释

1.变性和杂交

变性涉及退火DNA链的分离，使双链DNA变成单链。杂交即将DNA样本与特定探针杂交。由于它是一种多路复用技术，可以同时使用多达60个探头分析每个样本，从而针对不同的位点。这些探针具有引物序列，在扩增过程中与PCR -引物结合。所有不同的探针都有相同的引物结合序列，此外，探针还具有与目标位点互补的杂交序列，使探针能够与DNA结合。两种探针将在DNA链的相邻位点杂交。

这对探针中的一个包含一个填充序列，每个目标位点的填充序列长度不同。填充序列的长度在不同的探针之间变化，允许多路复用。所以每个放大产物都有一个唯一的长度。

2.连接

连接步骤将两个探针结合在一起，在这个步骤中，使用一种叫DNA连接酶的特定的酶，它与已经在目标位点DNA链相邻位点杂交的探针结合。MLPA中使用的连接酶是ligase-65，这是一种依赖于NAD的连接酶，在其他应用中也很有用。

如果我们的目标是连接两个探针，为什么它们一开始是分开的分子? 两种探针都含有PCR-引物的结合位点。这意味着，如果我们将探针作为单个分子使用，即使没有DNA靶点，我们也可以得到扩增产物，从而得到非特异性扩增。连接酶是非常特异性的，如果探针与目标位点不匹配，连接酶将无法与探针结合，也不会发生扩增。因此，MLPA可以检测特定的点突变，甚至可以区分伪基因和真正的靶基因。

 

3.扩增

下一步是扩增，实质上是聚合酶链反应(PCR)。在PCR步骤中，加入聚合酶、dNTPs和正向、反向引物。由于所有的探针都有相同的PCR-引物序列，因此只需要添加一对通用引物就可以研究我们所有的目标。正向引物荧光标记，使分析过程可视化和得以定量。

4.片段分离和数据分析

扩增后，用毛细管电泳分离片段。毛细管电泳根据片段的长度进行分离，并将不同长度的片段显示为峰值模式，称为电泳图。每个探针上的填充序列不同，每个扩增子都有不同的已知大小，因此在数据分析过程中可以对每个扩增子进行量化。

毛细管电泳得到的数据将作为分析的输入，输入数据分析软件Coffalyser。通过将每个样本与一组参考样本进行比较，我们可以得到一个探针比，这个探针比率将告诉我们一个基因有多少个拷贝数。由于大多数人类基因是二倍体，如果样本有两个拷贝，比例将为1.0，即样本探针获得的基因数量与参考样本相同。如果比值为0.5，则该基因在个体中只有一个拷贝，这可能意味着目标基因的杂合缺失。另一方面，如果这个比率是1.5，那么很可能存在一个基因的杂合复制。

MLPA技术的优缺点

1.MLPA是一种高灵敏度、高特异性、高通量检测技术，操作简便、准确度高、重复性强。
2.可以识别点突变，以及基因的复制/删除，比测序等只能找到点突变的技术有很大的优势。此外，MLPA可以检测到小的基因变化。
3.结果可以在24小时内得到，因为这是一个复杂的反应，它允许快速和有效地收集信息。
4.对MLPA的小修改可以支持多种应用程序。例如，通过添加额外的消化步骤，MLPA还可以用于检测DNA中的甲基化模式【甲基化特异性-MLPA (MS-MLPA)】。

MLPA技术有很多的优点，也有很多的局限性。MLPA对杂质极其敏感，因此，在制备样品和操作该技术时需要非常小心。由于罕见的多态性或突变，探针的信号可能会减少，可能需要使用其他技术对其进行测试。