公司新闻/正文
【技术贴】双向电泳-样品制备详细步骤
人阅读 发布时间：2019-05-28 15:56
介绍：
样品制备是双向电泳中最关键的步骤，这一步处理的好坏将直接影响2-DE结果。但是目前来说，并没有一个比较标准或者通用的提取方法，不过基本来说，样品制备过程中都必须满足一些基本原则：
1）提高样品蛋白的溶解度，避免蛋白的丢失，使抽提的总蛋白具有代表性；这主要依靠蛋白溶解液的配方决定，可以采用高溶解能力的蛋白溶解液一次溶解，也可用采用不同溶解能力的蛋白溶解液分次溶解，同时增加溶解的时间同时结合其它一些手段比如超声溶解等可以达到较好的效果；
2）减少对蛋白质的人为修饰，使得实验结果尽量能反应生物体的本来面目；这主要依靠减少操作步骤同时严格操作来解决这个问题，除了这两点以外，其它的一些原则也需适当注意，包括：破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态，尽量降低蛋白酶的降解作用同时注意防止外源蛋白的污染。
常用试剂：
尿素、CHAPS乙、DTT、两性电解质、三氯酸。
试剂介绍：
尿素和 liú niào 是离液剂,也称变性剂，能够破坏蛋白分子间形成的氢键，防止蛋白质的集聚及二级结构的形成。CHAPS是表面活性剂，也称去垢剂，能够溶解变性后蛋白质的疏水基团，消除疏水基团之间的相互作用，增强蛋白的溶解性。DTT是还原剂，能帮助打开蛋白的二硫键，对于增强蛋白的溶解能力也非常重要。两性电解质可以替代盐离子的作用，使某些蛋白保持溶解状态，但又不会影响等电聚焦。另外，还可以选择性的加入蛋白酶抑制剂、核酸酶、Tris等。细胞破碎：不同样品有不同的细胞破碎办法，主要有机器捣碎法、液氮研磨法、超声剪切法、反复冻融法、直接裂解法，其中前面两种方法主要用于植物细胞，因为植物含有细胞避，增加了破碎的难度。而对于动物或微生物，常用直接裂解法，操作简单，效果也不错。
部分常用配方：
（1）9M尿素，4%CHAPS，1%DTT，1%两性电解质
（2）8M尿素，4%CHAPS，1%DTT，1%两性电解质
（3）7M尿素，2Mliú niào，4%CHAPS，1%DTT，1%两性电解质
（4）9M尿素，4%CHAPS，1%DTT，40mMTis，1%两性电解质
实验操作：
A，单细胞样品蛋白的提取：
1，细胞收集：2000g左右离心收集沉淀
2，蛋白提取：按2*107细胞加1ml蛋白提取液的比例进行蛋白溶解，在36度水浴溶解1小时。
3，室温超声处理2分钟，15000g离心15分钟取上清，即为提取后的蛋白溶液。
B，动物组织样品蛋白的提取
1，匀浆机匀浆或液氮研磨
2，蛋白提取：按0.1g鲜样加1ml蛋白提取液的比例进行蛋白溶解，在36度水浴溶解1小时。
3，室温超声处理2分钟，15000g离心15分钟取上清，即为提取后的蛋白溶液。
C，植物组织样品蛋白的提取
1，液氮研磨成粉末状
2，按1g样品加入10ml 三lv乙酸-丙同提取液（10%TCA，0.07%DTT的丙同溶液）的比例进行混合，-20度放置1小时。
3，4℃，15000g离心力，离心15分钟，取沉淀。
4，采用10ml含巯基乙醇的丙同溶液沉淀，-20度放置1小时，4℃，15000g离心力，离心15分钟，取沉淀。
5，重复3、4步骤一次。
6，真空干燥沉淀成粉末状。
7，按1mg粉末加入50ul样品溶解液的比例对干粉进行溶解。
8，36度水浴溶解1小时，然后在室温下超声处理2分钟。
9，室温下15000g离心15分钟，取上清，即为提取后的蛋白溶液。
小经验：样品提取后常遇到的问题是盐离子浓度过高以至于8000V电压不容易上去，对于这个问题，一个解决办法是盐析（知道，但没用过），另一个办法是丙同重新沉淀，即将蛋白溶解液按照1：5的比例重新沉淀在含0.07%DTT的丙同溶液中，-20度放置1小时并重新离心取沉淀干燥后溶解。不过最好不要用这个办法，因为这样操作无疑增加了操作步骤，增加了人为引起的差异。另外，对于某些特殊的样品提取，也有一些比较特别的注意事项，比如血清等含有高丰度蛋白的样品，一般需要购买特异的高丰度蛋白去除试剂盒，去除血清里面的高丰度蛋白，对于含有细胞壁的某些菌类等单细胞生物（大肠杆菌等），最好采用液氮研磨的方式充分破碎细胞，以达到好的提取效果。
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
辉骏生物公司在蛋白质组学、分子生物学、病毒包装等实验拥有深厚的经验积累，服务项目包括样本制备、双向电泳、图像分析、胶内酶切、蛋白质鉴定、质谱分析、数据库查询与结果分析、免疫印迹及磷酸化蛋白质检测。
更多实验请联系我们
企业QQ：4006991663
电话：400-699-1663 / 020-32053431
邮箱：service@fitgene.com
官网：www.fitgene.com
丁香通：https://fitgene.biomart.cn
地址：广州市萝岗区科学城广州国际企业孵化器D506
样品制备是双向电泳中最关键的步骤，这一步处理的好坏将直接影响2-DE结果。但是目前来说，并没有一个比较标准或者通用的提取方法，不过基本来说，样品制备过程中都必须满足一些基本原则：
1）提高样品蛋白的溶解度，避免蛋白的丢失，使抽提的总蛋白具有代表性；这主要依靠蛋白溶解液的配方决定，可以采用高溶解能力的蛋白溶解液一次溶解，也可用采用不同溶解能力的蛋白溶解液分次溶解，同时增加溶解的时间同时结合其它一些手段比如超声溶解等可以达到较好的效果；
2）减少对蛋白质的人为修饰，使得实验结果尽量能反应生物体的本来面目；这主要依靠减少操作步骤同时严格操作来解决这个问题，除了这两点以外，其它的一些原则也需适当注意，包括：破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态，尽量降低蛋白酶的降解作用同时注意防止外源蛋白的污染。
常用试剂：
尿素、CHAPS乙、DTT、两性电解质、三氯酸。
试剂介绍：
尿素和 liú niào 是离液剂,也称变性剂，能够破坏蛋白分子间形成的氢键，防止蛋白质的集聚及二级结构的形成。CHAPS是表面活性剂，也称去垢剂，能够溶解变性后蛋白质的疏水基团，消除疏水基团之间的相互作用，增强蛋白的溶解性。DTT是还原剂，能帮助打开蛋白的二硫键，对于增强蛋白的溶解能力也非常重要。两性电解质可以替代盐离子的作用，使某些蛋白保持溶解状态，但又不会影响等电聚焦。另外，还可以选择性的加入蛋白酶抑制剂、核酸酶、Tris等。细胞破碎：不同样品有不同的细胞破碎办法，主要有机器捣碎法、液氮研磨法、超声剪切法、反复冻融法、直接裂解法，其中前面两种方法主要用于植物细胞，因为植物含有细胞避，增加了破碎的难度。而对于动物或微生物，常用直接裂解法，操作简单，效果也不错。
部分常用配方：
（1）9M尿素，4%CHAPS，1%DTT，1%两性电解质
（2）8M尿素，4%CHAPS，1%DTT，1%两性电解质
（3）7M尿素，2Mliú niào，4%CHAPS，1%DTT，1%两性电解质
（4）9M尿素，4%CHAPS，1%DTT，40mMTis，1%两性电解质
实验操作：
A，单细胞样品蛋白的提取：
1，细胞收集：2000g左右离心收集沉淀
2，蛋白提取：按2*107细胞加1ml蛋白提取液的比例进行蛋白溶解，在36度水浴溶解1小时。
3，室温超声处理2分钟，15000g离心15分钟取上清，即为提取后的蛋白溶液。
B，动物组织样品蛋白的提取
1，匀浆机匀浆或液氮研磨
2，蛋白提取：按0.1g鲜样加1ml蛋白提取液的比例进行蛋白溶解，在36度水浴溶解1小时。
3，室温超声处理2分钟，15000g离心15分钟取上清，即为提取后的蛋白溶液。
C，植物组织样品蛋白的提取
1，液氮研磨成粉末状
2，按1g样品加入10ml 三lv乙酸-丙同提取液（10%TCA，0.07%DTT的丙同溶液）的比例进行混合，-20度放置1小时。
3，4℃，15000g离心力，离心15分钟，取沉淀。
4，采用10ml含巯基乙醇的丙同溶液沉淀，-20度放置1小时，4℃，15000g离心力，离心15分钟，取沉淀。
5，重复3、4步骤一次。
6，真空干燥沉淀成粉末状。
7，按1mg粉末加入50ul样品溶解液的比例对干粉进行溶解。
8，36度水浴溶解1小时，然后在室温下超声处理2分钟。
9，室温下15000g离心15分钟，取上清，即为提取后的蛋白溶液。
小经验：样品提取后常遇到的问题是盐离子浓度过高以至于8000V电压不容易上去，对于这个问题，一个解决办法是盐析（知道，但没用过），另一个办法是丙同重新沉淀，即将蛋白溶解液按照1：5的比例重新沉淀在含0.07%DTT的丙同溶液中，-20度放置1小时并重新离心取沉淀干燥后溶解。不过最好不要用这个办法，因为这样操作无疑增加了操作步骤，增加了人为引起的差异。另外，对于某些特殊的样品提取，也有一些比较特别的注意事项，比如血清等含有高丰度蛋白的样品，一般需要购买特异的高丰度蛋白去除试剂盒，去除血清里面的高丰度蛋白，对于含有细胞壁的某些菌类等单细胞生物（大肠杆菌等），最好采用液氮研磨的方式充分破碎细胞，以达到好的提取效果。
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
辉骏生物公司在蛋白质组学、分子生物学、病毒包装等实验拥有深厚的经验积累，服务项目包括样本制备、双向电泳、图像分析、胶内酶切、蛋白质鉴定、质谱分析、数据库查询与结果分析、免疫印迹及磷酸化蛋白质检测。
更多实验请联系我们
企业QQ：4006991663
电话：400-699-1663 / 020-32053431
邮箱：service@fitgene.com
官网：www.fitgene.com
丁香通：https://fitgene.biomart.cn
地址：广州市萝岗区科学城广州国际企业孵化器D506
询价列表
暂时没有已询价产品
快捷询价 发送名片
当你希望让更多商家联系你时，可以勾选后发送询价，平台会将你的询价消息推荐给更多商家。