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慢病毒操作手册

人阅读 发布时间:2019-07-22 16:19

1、慢病毒滴度的测定
病毒的滴度即每毫升溶液中含有的病毒感染单位(TU)。滴度值用于测定慢病毒所含有效感染单位的浓度。

辉骏生物采用的慢病毒滴度测定方法为逐孔稀释法,具体操作方法如下:

(1)实验准备:一块96孔板,最大量程为10µL和100µL的移液枪各一支,小、中枪头各一盒,1.5mL EP管若干个,完全培养基(ph7.2)。
(2)实验前,培养293T细胞使其处于良好的生长状态;
(3)滴度测定前一天,为培养好的293T细胞换液,并将其接种至96孔板中,每孔的细胞数目约为0.3~1.0×104个,培养基体积为100µL。
(4)病毒稀释:取10个无菌的EP管,每管加入90µL新鲜的完全培养基,之后取10µL病毒原液加入第一个EP管中,混匀后从中吸取10 µL加入第二个EP管中;以此类推,将病毒原液依次地进行10倍稀释。
(5)每个细胞培养孔小心吸去90 µL培养基(共10个孔),之后分别加入稀释好的病毒液,这样第一管中的病毒液即为9µL,为方便计算,这里按10 µL算;以此类推,其它孔的病毒量分别1 µL、10-1 µL、 10-2 µL等。
(6)将接种好病毒的细胞培养板放回37℃、5% CO 培养箱中;48小时后,每孔分别加入新鲜培养基100 µL。
(7)96小时后观察荧光表达情况,数出最后两个含有荧光细胞的孔中的荧光细胞个数;病毒原液的滴度值=荧光细胞个数/稀释后的病毒量。假设第7个孔的发光个数为3个,稀释后的病毒实际体积为10-5µL,则病毒液的滴度为3×103/10-5 =3×108(TU/mL)。

2、慢病毒感染预实验
慢病毒颗粒对不同细胞系的亲嗜性不一,原代细胞或者难感染的细胞通常需要较高的MOI,因此建议首先用慢病毒对靶细胞进行预感染,设定不同的MOI梯度(1、10、100等),以评估目的细胞的MOI。实验准备:一块96孔板,最大量程为10µL和100µL的移液枪各一支,小、中枪头各一盒,1.5mL EP管若干个,polybrene、FItransfer和完全培养基。

A. 贴壁细胞的感染:
(1)培养细胞使其处于良好的生长状态;在实验前一天,将0.3×104~1.0×104个细胞接种至96孔板内,每孔100 µL培养基。
(2)待细胞汇合度为20%~50%之间时,可以使用慢病毒进行感染。
(3)预实验可设置3组,分别为:完全培养基组、完全培养基
+polybrene组、FItransfer组;polybrene的使用量为 5-10 µg/mL之间,FItransfer为辉骏生物开发的优化过的助感染培养基,可直接当作感染完全培养基,无需额外添加其他助感染试剂,具有增强感染效率的作用;每组设置3个不同的MOI值,以寻找慢病毒感染的最适条件。
(4)病毒稀释:实验前准备2个1.5 mL的无菌EP管,将冰浴解冻的1×108的病毒液分别稀释为10倍、100倍,具体操作步骤为:取10µL 1×108 TU/mL的病毒液加入90µL完全培养基中,则此时病毒液的滴度为1×107 TU/mL,病毒量为106TU;再从此溶液中吸取10µL病毒液加入90µL完全培养基中,此时病毒液的滴度为1×106 TU/mL,病毒量为105TU。吸取病毒液的过程中尽量避免产生泡沫。
(5)polybrene稀释:polybrene的使用量为每孔5 µg/mL,可预先加入完全培养基中。
6)感染前,小心吸去培养基,每孔分别加入90µL对应的完全培养基或FItransfer;从三管不同滴度(1×108TU/mL、1×107TU/mL、 1×106TU/mL)的病毒液中分别吸取10µL加入对应的孔中,即加入的病毒量分别为1×106 TU、1×105TU、1×104TU;每个孔内液体的总体积为100µL,细胞的数目大约为1×104个,因此每组中3孔的MOI值分别为100、10、1。
(7)将培养基和病毒等试剂轻轻地充分混匀,之后放入培养箱中培养。
(8)感染8~16小时后观察细胞状态,弃去感染培养基,并加入100µL新鲜培养基。
(9)慢病毒感染3~4天后观察荧光;如果细胞生长比较缓慢,可以适当延长观察时间,如感染的慢病毒带有抗性筛选元件,则可以开始换液加药筛选。

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