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【技术贴】脂质体转染方法

人阅读 发布时间:2019-07-22 16:12

外源基因进入细胞主要有四种方法:电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入;磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞;病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大;病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响;所以现在对于很多普通细胞系,一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。
 

利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性,因此脂质体与质粒的比例,细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题,通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。

 

1、细胞传代

1)弃掉培养皿中的培养基,用1ml的PBS溶液洗涤两次。

2)用移液枪加入1ml胰酶,消化1min(37℃,5% CO2)。用手轻拍培养瓶壁,观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。

3)加入1ml的含血清培养基终止反应。

4)用移液枪多次吹吸,使细胞完全分散开。

5)将培养液装入离心管中,1000rpm离心5min。

6)用培养液重悬细胞,细胞计数后选择0.8 x 106个细胞加入一个35mm培养皿。

7)将合适体积完全培养液加入离心管中,混匀细胞后轻轻加入培养皿中,使其均匀分布。

8)将培养皿转入CO2培养箱中培养,第二天转染。

 

2、细胞转染

1)转染试剂的准备

A、将400ul去核酸酶水加入管中,震荡10s,溶解脂状物。

B、震荡后将试剂放在-20℃保存,使用前还需震荡。

2)选择合适的混合比例(1:1-1:2/脂质体体积ul:DNA质量ug)来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA,震荡后在加入合适体积的转染试剂,再次震荡。

3)将混合液在室温放置10-15min。

4)吸去培养板中的培养基,用PBS或者无血清培养基清洗一次。

5)加入混合液,将细胞放回培养箱中培养一个小时。

6)到时间后,根据细胞种类决定是否移除混合液,之后加入完全培养继续培养24-48h。

 

3、第二次细胞传代

1)在转染后24h,观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。

2)再次进行细胞传代,按照免疫染色合适的密度0.8 x 105个细胞/35mm培养皿将细胞重新分入培养皿中。

3)在正常条件下培养24h后,按照染色要求条件固定。

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