ChIP-seq是一种结合免疫共沉淀和二代测序来研究组蛋白或转录因子与DNA之间相互作用的技术。在这类研究中，很多因素都会影响研究结果，因此要做足功课才能获得一个接近完美的研究结果。需要做哪4大准备工作？辉骏生物带着大家一起来学习了解ChIP实验操作流程。
 

1、样本准备

ChIP实验中不同的研究对象需要的样本量是不同的。因组蛋白的表达量相对较高，如果研究组蛋白与DNA的相互作用，需准备的细胞量为105-106；而转录因子的表达量相对较少，需要的细胞量就相对较高，需准备的细胞量为106-107。当样本是组织时，就需根据组织样本能提出的染色质量决定，与植物相比，一般动物组织需求量较少。
 

2、抗体选择

ChIP实验中需求的抗体至少是ChIP级，即我们在查询抗体时需有“ChIP-Grade”标识。一般常见的组蛋白H3K4me3、H3K9me3等都有对应的ChIP级商业化抗体，常用的抗体牌子有abcam、merck millipore等。对于没有ChIP级抗体的组蛋白或转录因子，可通过转标签蛋白进行，最经常使用的标签包括HA、Flag、GFP、c-myc等。
 

我们可通过两种方式验证抗体是否可以跨物种使用：

通过WB实验验证抗体有无特异性。若特异性较强，该抗体就可以跨物种使用。

通过比对目的蛋白在两个物种中序列的同源性。若同源性在80%以上，该抗体就可以跨物种使用。

 

3、生物学重复

ChIP-seq是否要设置生物学重复一直是大家比较关心的问题。由于ChIP实验操作难度较大、步骤繁琐、影响因素多， 所以ChIP-seq中生物学重复的一致性相对较差，很多人都不建议设置生物学重复。但近几年很多高分文章在进行ChIP-seq研究时都设置了大量的生物学重复。鉴于这两种情况，我们可以得出两个结论：ChIP-seq可以不设置生物学重复；如果设置生物学重复，要尽可能增加重复个数。
 

4、对照设置

做ChIP实验时经常要设置非特异抗体IgG为阴性对照，那么ChIP-seq需要用IgG富集的产物进行背景噪音的去除吗？No！一般不建议用IgG产物作为ChIP-seq的对照，原因如下：

大多数IgG抗体与转录因子或组蛋白抗体不是来源于同一动物的免疫前血清。IgG通常能富集到很少的DNA，导致后期建库过程中PCR循环数增加，不能达到作为对照去除背景噪音的目的。Input可以很好的避免上述问题，起到去除背景噪音的作用。此外通过IP与input比较可以验证染色质断裂效果。

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